Il danno che un materiale fa a una cellula in coltura
La citotossicità è la capacità di una sostanza o di un materiale di produrre un effetto tossico sulle cellule. Nel linguaggio dei dispositivi medici non è una proprietà che si attribuisce a occhio: è l’esito di una prova di laboratorio, condotta su cellule coltivate, con un metodo e un criterio scritti.
Questo va tenuto fermo perché la stessa parola circola in due mondi diversi. In farmacologia un farmaco citotossico è un farmaco che uccide le cellule per mestiere, ed è quello che gli si chiede. Nella valutazione di un dispositivo la citotossicità è invece un segnale d’allarme: dice che dal materiale esce qualcosa che le cellule non tollerano.
La norma che definisce la prova di citotossicità
Il riferimento è la ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices, parte 5, Tests for in vitro cytotoxicity. L’edizione di riferimento è la terza, pubblicata il primo giugno 2009, che annulla e sostituisce la seconda del 1999; il testo è opera del comitato tecnico ISO/TC 194.
Lo scopo dichiarato è stretto: la norma descrive metodi per valutare la citotossicità in vitro dei dispositivi medici incubando cellule in coltura a contatto con il dispositivo o con i suoi estratti, direttamente o per diffusione, e misurando la risposta biologica di cellule di mammifero con parametri biologici appropriati.
Va letta anche la scelta di fondo dichiarata nell’introduzione: la norma non impone una prova sola, definisce uno schema di decisioni successive. Le vie possibili sono raggruppate in quattro categorie di valutazione, cioè osservare al microscopio il danno alle cellule, misurare quel danno, misurare la crescita cellulare oppure misurare un aspetto specifico del metabolismo.
Estratto, contatto diretto, contatto indiretto
Le categorie di prova sono tre, e la scelta dipende dalla natura del campione, da dove verrà impiegato e da come.
Nella prova su estratto il materiale viene messo in un liquido di estrazione, e sulle cellule si porta l’estratto, non il pezzo. La norma fissa quattro condizioni alternative: ventiquattro ore a 37 °C, settantadue ore a 50 °C, ventiquattro ore a 70 °C oppure un’ora a 121 °C. Per i campioni polimerici avverte che la temperatura di estrazione non deve superare la temperatura di transizione vetrosa del polimero, perché sopra quella soglia cambia ciò che il liquido tira fuori.
Nella prova a contatto diretto il campione viene appoggiato sullo strato di cellule. Nella prova a contatto indiretto fra i due si interpone un mezzo, per esempio uno strato di agar o un filtro, e ciò che arriva alle cellule ci arriva per diffusione.
In ogni caso accanto al campione corrono i controlli: un controllo positivo, cioè un materiale che una risposta citotossica la dà con certezza, un controllo negativo e un bianco. Se i controlli non si comportano come previsto, la prova si rifà da capo.
Come si legge il risultato di una prova di citotossicità
I criteri sono due, secondo che la lettura sia qualitativa o quantitativa.
La lettura qualitativa è morfologica: si guardano le colture al microscopio e si assegna un grado da 0 a 4, dove 0 è nessuna reattività e 4 è distruzione quasi totale o totale dello strato cellulare. Un grado superiore a 2 viene considerato effetto citotossico.
La lettura quantitativa misura invece un parametro oggettivo: il numero di cellule, la quantità di proteine, il rilascio di un enzima, l’assorbimento o la riduzione di un colorante vitale. Qui il criterio è un numero solo, una riduzione della vitalità cellulare superiore al 30% è considerata effetto citotossico. Detto al rovescio, ed è la forma in cui compare nei rapporti di prova, la soglia è il 70% di vitalità rispetto al bianco.
Gli allegati della norma descrivono protocolli di uso corrente, fra cui il saggio con il rosso neutro e quelli al MTT e all’XTT, condotti su cellule della linea L929. Gli allegati non sono prescrittivi: altri criteri, altri punti di taglio o altre linee cellulari si possono adottare, purché la scelta venga motivata e messa a verbale.
Il posto della citotossicità nella valutazione biologica
La prova non vive da sola: è una tessera della valutazione biologica governata dalla ISO 10993-1, la parte della serie che inquadra il tutto dentro un processo di gestione del rischio, e si appoggia alla ISO 10993-12 per la preparazione dei campioni.
Nel quadro generale la citotossicità è uno degli esiti da considerare per ogni dispositivo, insieme a irritazione e sensibilizzazione, e nella pratica è la prima prova che si esegue. La ragione è che è sensibile, rapida e poco costosa: una coltura cellulare reagisce a quantità di sostanza rilasciata molto minori di quelle che darebbero un effetto misurabile in altre prove. Per questo lavora da setaccio, e intercetta presto un problema di formulazione, un residuo di lavorazione, un additivo che migra o un residuo di sterilizzazione.
Il rovescio della sensibilità è che un esito citotossico non equivale a un rischio per il paziente. Segnala che dall’estratto esce qualcosa di attivo sulle cellule in coltura, e da lì parte un lavoro di identificazione chimica e di valutazione tossicologica che stabilisce se e quanto quel qualcosa conti nelle condizioni d’uso reali.
Citotossico, citostatico, genotossico
Tre aggettivi che si somigliano e non si sovrappongono.
Citotossico descrive ciò che danneggia o uccide la cellula. Citostatico descrive ciò che ne blocca la moltiplicazione senza per forza ucciderla: la coltura non muore, smette di crescere, ed è una distinzione che nei saggi si legge confrontando vitalità e proliferazione. Genotossico descrive invece il danno al materiale genetico, mutazioni comprese, e nella serie sui dispositivi ha una parte sua, la ISO 10993-3.
Resta una precisazione sulla dicitura non citotossico. Non è una qualità permanente del materiale: è il risultato di una prova condotta su un certo campione, con un certo estratto e un certo criterio. Cambiare processo, additivo o metodo di sterilizzazione può cambiare l’esito senza che cambi il nome del materiale.
