Anticorpi che viaggiano su una membrana
Un saggio immunocromatografico è un saggio immunologico in cui il campione liquido migra per capillarità lungo un supporto poroso e la reazione fra antigene e anticorpo si manifesta come una linea colorata, leggibile a occhio nudo. È il principio dei test rapidi a striscia, che le fonti tecniche chiamano anche test a flusso laterale o immunodosaggio a flusso laterale.
Il nome tiene insieme due cose. Immuno rimanda al riconoscimento fra un anticorpo e la molecola che lega; cromatografia indica una separazione ottenuta facendo scorrere una fase mobile attraverso una fase stazionaria. Qui la fase mobile è il campione stesso, la fase stazionaria è una membrana, e il motore non è una pompa ma la capillarità del materiale poroso. Non servono incubazioni cronometrate, lavaggi o uno strumento di lettura: il flusso e il colore fanno tutto il lavoro.
Com’è fatta una striscia immunocromatografica
Gli strati sono sovrapposti in sequenza e ciascuno ha un compito. Il primo tampone riceve il liquido e ne regola l’ingresso. Il secondo è il deposito del coniugato: contiene particelle essiccate in una matrice di sali e zuccheri, che si rimettono in sospensione appena il fronte liquido le raggiunge. Le particelle portano legato un anticorpo e un segnale visibile, di solito oro colloidale, che appare rosso per risonanza plasmonica di superficie localizzata, oppure lattice colorato, tipicamente blu.
Segue la membrana vera e propria, quasi sempre di nitrocellulosa, dove sono immobilizzate due bande sottili di reagenti: la linea di test e la linea di controllo. In fondo un tampone assorbente continua a richiamare liquido e mantiene il flusso in una sola direzione finché la striscia non è satura.
Perché la linea di controllo deve comparire sempre
La linea di controllo non riguarda la molecola cercata. Contiene un legante di affinità che ferma una parte delle particelle rimaste libere dopo il passaggio sulla linea di test, di solito un anticorpo diretto contro le immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto l’anticorpo coniugato.
Comparendo dice due cose insieme: che il liquido ha attraversato tutta la membrana, oltre la linea di test, e che le particelle coniugate sono ancora reattive. Sono le due condizioni senza le quali la linea di test non avrebbe potuto formarsi comunque fossero andate le cose. Se la linea di controllo non compare, nessuna delle due è dimostrata, e la striscia non ha prodotto un esito debole o negativo: non ha prodotto alcun esito. Per questo una striscia con la sola linea di test, o senza alcuna linea, si scarta invece di interpretarla.
Sandwich e competizione, due formati che si leggono al contrario
Nel formato a sandwich la molecola cercata è grande abbastanza da offrire due punti di attacco distinti: viene presa dall’anticorpo coniugato mentre migra e trattenuta sulla linea di test da un secondo anticorpo immobilizzato, che la aggancia sull’altro punto. Le particelle si accumulano dove sono ferme e la banda si colora. Più materiale passa, più segnale si deposita.
Nel formato competitivo la molecola è piccola e offre un solo punto di attacco, quindi il sandwich non si può costruire. Sulla linea di test viene fissato un analogo della molecola, che si contende gli stessi anticorpi coniugati con quella eventualmente presente nel campione. Se il campione ne porta, gli anticorpi arrivano già occupati e la banda resta scarica. Il segno è rovesciato rispetto al sandwich, ed è la ragione per cui due strisce identiche a vedersi possono chiedere letture opposte.
Sensibilità e specificità di un test immunocromatografico
I due numeri che accompagnano un metodo diagnostico descrivono cose diverse e non sono intercambiabili. La sensibilità è la probabilità che chi ha la condizione dia un esito positivo, cioè la percentuale di veri positivi, ed è complementare alla percentuale di falsi negativi. La specificità è la probabilità che chi non ha la condizione dia un esito negativo, cioè la percentuale di veri negativi, ed è complementare alla percentuale di falsi positivi. Entrambe si misurano confrontando il metodo con uno standard di riferimento.
Sono proprietà del metodo, non del singolo esito. Quanto un esito corrisponda alla realtà si chiama valore predittivo, e quello dipende anche dalla prevalenza della condizione nella popolazione esaminata: a parità di sensibilità e specificità cambia con quanto la condizione è frequente. Leggere il valore predittivo dentro i due numeri dichiarati dal fabbricante è l’equivoco più comune su questi metodi.
Linee deboli, effetto gancio e finestra di lettura
L’intensità di una banda dipende da quante particelle marcate restano ferme lì, e quella quantità non è funzione della sola concentrazione: contano il volume di campione arrivato, la velocità di migrazione e il tempo trascorso. Per questo le istruzioni fissano una finestra di lettura, prima e dopo la quale il quadro cambia.
Nel formato a sandwich esiste inoltre un comportamento controintuitivo, l’effetto gancio. Quando la molecola cercata è in eccesso molto forte, satura separatamente gli anticorpi coniugati e quelli immobilizzati, il complesso a tre non si forma e l’intensità della linea di test cala invece di crescere. Uno studio sistematico su saggi per allergeni alimentari ha mostrato che nello stesso intervallo si indebolisce anche la linea di controllo, perché l’antigene in eccesso riduce l’avidità con cui il coniugato vi si lega. Una banda pallida, quindi, non si legge da sola.
Immunocromatografici, immunoenzimatici e molecolari
Un metodo immunoenzimatico coniuga all’anticorpo un enzima invece di una particella colorata e ha bisogno di un substrato, di lavaggi e di una lettura fotometrica in micropiastra: sta in laboratorio e restituisce un numero. Un metodo molecolare non cerca affatto una proteina ma amplifica una sequenza di acido nucleico, e cambia quindi il bersaglio prima ancora della tecnica.
Rispetto a entrambi il saggio immunocromatografico rinuncia alla misura per stare fuori dal laboratorio: nessuno strumento, esito in minuti, lettura qualitativa o al più semiquantitativa. Sui nomi vale la pena sapere che immunocromatografia, test a flusso laterale e test immunocromatografico indicano la stessa famiglia, mentre test rapido è un’etichetta più larga, che comprende anche metodi senza membrana.
